针剂生产过程内毒素控制方法总结 本文关键词：内毒素，针剂，生产过程，控制，方法
针剂生产过程内毒素控制方法总结 本文简介：针剂生产过程内毒素控制方法总结2012年一、基本概念细菌内毒素：只在细菌被破坏时才被释放的细菌毒素。某些革兰阴性菌(如布鲁菌、肠杆菌、奈瑟菌、弧菌等)外膜相关的热稳定毒素，主要成分是脂多糖，在固有免疫及B细胞的多克隆激活中发挥作用。检测方法：由于内毒素是细菌死亡裂解或自溶引起的，因此环境中大量存在内
针剂生产过程内毒素控制方法总结 本文内容：
针剂生产过程内毒素控制方法总结
2012年
一、基本概念
细菌内毒素：只在细菌被破坏时才被释放的细菌毒素。某些革兰阴性菌(如布鲁菌、肠杆菌、奈瑟菌、弧菌等)外膜相关的热稳定毒素，主要成分是脂多糖，在固有免疫及B细胞的多克隆激活中发挥作用。
检测方法：由于内毒素是细菌死亡裂解或自溶引起的，因此环境中大量存在内毒素。当内毒素通过机体消化道等方式时并无危害，少量通过注射等方式进入血液后被肝脏枯否细胞灭活，不造成机体损害。内毒素大量进入血液就会引起发热反应—“热原反应”。内毒素大量进入、集聚于血液中，超过机体各自卫系统的清除能力，则可导致不同程度的内毒素血症。对于易于引入内毒素的药品医疗器械等必须通过内毒素检测。内毒素的检测常用家兔热原法和鲎试验法。中国药典收录的细菌内毒素检查法包括2种方法：凝胶法和光度法（分为浊度法和显色法），使用鲎试剂来定性或定量检测内毒素。
二、内毒素监控体系的构建
控制药品内毒素应从体系上总体控制，药品成分，容器密封件，设备和储存时间限度均在规定的内毒素控制范围内。适当的设备清洁、干燥、存放可以使生物负荷得到控制，防止内毒素的扩散。设备的设计应该使之很容易拆装、清洁、消毒、和/
或灭菌。在无菌过滤前和无菌过滤后都应该对所有产品接触表面进行内毒素控制。通过高温干热灭菌使内毒素失活，或用经过验证的清洁方法除去设备表面的内毒素。一些CIP程序开始时用适当的高纯度水或/
和洗涤剂(如:酸、碱、表面活性剂)
冲洗，然后用热的注射用水作最后冲洗。设备在清洁后要干燥。灭菌级过滤器和湿热灭菌在去除内毒素方面没有显出有效。设计用于去热原的过程应该达到3
位对数内毒素减少。
内毒素监控体系如表1
表1细菌内毒素监控体系
2.1
监控对象
--重要的媒体及原料
水是制药工艺最重要的媒体，是首要的监控对象
使用大量的原料
--生产过程添加的各种辅剂
--与中间体接触的各种用具、器皿及终产品的包装容器
--各工序前后中间体内毒素水平的变化
至少在生产过程的重要工序之间要设置监测点，例如在除热源工序后设置监测点。又如在分装工序前需抽检，确保中间体内毒素水平不超出控制水平才进行分装。
烘箱等除热源设备的验证
2.2
建立内毒素监控体系的步骤
确定药品的内毒素限值L；
分析药品生产过程，合理设置内毒素监测点；
制定各监测点合理的内毒素控制水平Lx；
进行干扰性验证试验确定各检测样品的有效浓度或有效稀释范围，选择所用鲎试剂的灵敏度；
进行日常的内毒素检测检查。
三、影响针剂内毒素的因素及应对措施
3.1、鲎试剂抗干扰能力
鲎试剂是由海洋生物鲎的血液变形细胞溶解物制成的无菌冷冻干燥品，含有能被微量细菌内毒素和真菌葡聚糖激活的凝固酶原，凝固蛋白原，能够准确、快速地定性或定量检测样品中是否含有细菌内毒素和（1,3）-β-葡聚糖激。
3.1.1、鲎试剂灵敏度的差异
不同厂家的鲎试剂虽然标示值（λ）相同，但仍然存在较大的误差。比如，标示值为0.5EU/ml的鲎试剂，若有的产品真实灵敏度可能是0.75EU/ml或1.0EU/ml；而另一个厂家的鲎试剂可能是0.35EU/ml或0.25EU/ml时，按0.5-2λ误差标准都是合格产品，但对同一检品虽然在相同的稀释倍数下，这两个厂家的鲎试剂产品对内毒素的检出水平却不同。
3.1.2、鲎试剂与内毒素脂多糖反应的差异
在正常的药品、生物制品生产时，因不同时期的原料来源和水源的因素，都可能导致半成品或成品污染的菌株不同，而导致内毒素脂多糖物质与鲎试剂反应的活性不同。有的鲎试剂对革兰氏阴性菌或各种微生物产生的内毒素脂多糖均有敏感性，有的鲎试剂可能只对革兰氏阴性菌产生的内毒素敏感而对其它微生物产生的内毒素脂多糖不敏感，故同一检品虽然在相同稀释倍数下，不同厂家的鲎试剂对内毒素的检出能力亦不同。
3.1.3、鲎试剂的特异性
指在药品、生物制品和血液制品中鲎试剂能准确测出被测物质内毒素的能力，既不能造成样品内毒素的漏检，也不能将其它物质错判为内毒素。已知能与鲎试剂发生反应的物质有细菌内毒素和β-葡聚糖，而内毒素反应曲线为S型特征曲线，β-葡聚糖反应曲线为经过0点的斜线。鲎试剂的特异性（专属性）差的另一种表现，是将其它物质（如β-葡聚糖）判定为内毒素，错误将合格药品判为不合格。
3.2、检验方法
鲎试剂与内毒素的反应为一系列酶反应，生物酶反应受许多因素的干扰。在日常工作中，要特别注意一些因素对试验结果的影响，如PH值、器皿的洁净度以及环境因素等。
图2
鲎试剂与内毒素的反应机理
3.2.1、PH值：鲎试剂生物活性在pH
6-8时酶活性稳定；pH
≤3
或≥10时，酶活性受到抑制。故鲎试验时，供试品
pH
最好应预调和6.8-8.0
为好，必要时可用无内毒素的
HCl
或NaOH
稀溶液调节
pH
值。
鲎试剂生产用水质量和BET水PH值的差异，可影响鲎试剂对内毒素脂多糖反应敏感性。有的鲎试剂生产公司（或厂）的原料用水不是多效蒸馏水，而是利用一般纯化水，而且PH值都在6.0以下。而鲎试剂的酶反应最佳PH值为6.8-8.0，所以一直以来美国、英国药典和日本药局方规定检品必须调节PH值6.0-8.0。
3.2.2、器皿的洁净度：内毒素稀释不宜用注射器，而应用经过校正的刻度玻璃吸管。因为注射器刻度准确度差，而且针栓壁磨沙面易吸附内毒素，试验误差大。同时要特别注意注射器针头引入的铁离子对试验结果的干扰，铁离子对鲎试验反应有较强的抑制作用。操作中常用的聚丙烯塑料管可能干扰试验结果，故宜慎用。
《中国生物制品操作规程》389页——细菌内毒素检查法“玻璃器皿的洗涤”规定：“将被洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并烘干水分后，置洗液中浸泡4小时，取出将洗液沥干，用自来水将残余的洗液洗净，再用新鲜蒸馏水冲洗干燥（禁用超纯水或久置的蒸馏水冲洗）后置适宜的密闭金属容器中，迅速置烤箱中，除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素。”应该特别注意，该规程明确规定最后冲洗玻璃器皿必须“用新鲜蒸馏水冲洗，禁用纯化水和久置的蒸馏水冲洗。”
假如使用反渗透制备的纯化水冲洗试验用玻璃器皿，结果试验中所有的阳性对照都为阴性，复核鲎试剂灵敏度时试验结果误差较大，这主要是由于纯化水和蒸馏水的内在质量不同所造成的。因纯化水中存在的阴阳离子经250℃高温干烤不能完全被破坏，这时不同的离子就产生对鲎试剂酶反应抑制或增强的反应，为了保证试验结果的准确性和检验报告的权威性，应该严格遵守操作规程，用新鲜多效蒸馏水冲洗鲎试验用玻璃器皿。
3.2.3、金属阳离子：离子对细菌内毒素测定结果影响较大，一方面阳离子如Fe3+、Al3+强度较大会引起内毒素的聚集造成内毒素局部浓度过高，同时还必须注意高价阳离子（如Fe3+）对鲎试剂酶反应具有强抑制作用；另一方面鲎试剂必须在二价阳离子Ca2+、Mg2+的参与下才能被激活形成凝胶反应。许多药物因PH值≥10时，其中的阴离子会吸收鲎试剂中的
Ca2+、Mg2+离子，使实验呈假阴性。
3.2.4、其它物质：如血液中的凝血因子、络合剂、抗凝剂等，都可能干扰鲎试剂与内毒素的反应，同时消毒剂和有机溶剂对鲎试验都有抑制作用。
3.3
水
注射用水既是注射剂等药品制备中的一种重要原料，也是灌装无菌产品的包装容器、生产中使用的相关设备、管道、工器具等的最后洗涤用水，其水质好坏，对无菌产品质量的影响是至关重要的。注射用水水质最大污染风险是微生物和热源。
注射用水水质的污染包括外源性和内源性污染。外源性污染包括进料水、排气口或由于系统存在泄漏而与外界污染接触所致；内源性污染是系统运行中产生的，可能是水处理设备单元储存于分配系统的设计、选材、安装、运行、维护和使用不当产生利于微生物生存、繁殖的生物膜所致。
注射用水系统的水质保证体系包括硬件、软件和人员。即硬件方面的合理设计、精心安装、严密验证、达标运行、有效监控和及时维护，只有在具有一定素质的人员，严格按相关软件要求去认真操作和管理，才能制造出合格的注射用水。
3.4
原料
用无菌过程生产的药品可能被一种或多种成分，在使用中可能受到微生物或内毒素的污染。应优先选择无菌原料药，无菌原料药精制工艺用水及直接接触无菌原料药的包装材料的最后洗涤用水应符合注射用水质量标准；其它原料药精制工艺用水应符合纯化水质量标准。于可能夹带内毒素的每批组分应有书面操作步骤及适当的接收或拒收标准。任何组分不符合规定的内毒素标准者都应该拒收。
如果无法保证原料药中内毒素限度，应尽量制定企业内控标准。
常见的去除原料药内毒素的方法有离子交换法、有机溶剂析晶法、超滤法、吸附法和高温灭菌法等。
国外流行的的是无炭化生产。国内一般采取在药液配制时，采用0.1%活性炭吸附除去热原，达到控制内毒素的目的。试验表明，活性炭只能除去80~90%除热原，而且还容易带入很多不可知杂质。按照目前的条件，大多数厂家还是用的它，只是对于不耐热只能无菌灌装的药液，药液的温度不是活性炭除热源的理想温度，所以效果弱些。这时活性炭除热源可以按照少量多次的方法来进行，比一次加入全量效果要好。
3.5
辅料
注射剂的辅料选择应遵循以下原则：①必须使用是前提（如稳定剂、增溶剂等）；②优先采用符合注射规格的辅料；③所用辅料的种类及用量应尽可能少；④应尽可能采用制剂剂常用的辅料（吐温80等）
对于非注射用辅料应严格控制，未批准供注射用的辅料：①在国外上市注射剂中已使用的进口辅料（原生产企业）。关注国外药用依据、执行标准及检验报告；②有注射使用依据，尚无符合注射用标准产品生产或进口的辅料。关注精制工艺及其选择依据、内控注射用标准的制定依据及其执行标准及检验报告；③必要时应关注其相关安全性试验资料。
对于非注射剂辅料，国内一般采取配制时，采用0.1%活性炭吸附除去辅料中的热原，达到控制内毒素的目的。
3.6
工器具及包材
3.6.1、工器具的清洗
对于无热原的非胃肠道用药容器和密封件应该规定为无菌。使用加工方法的类型首先取决于容器和/
或密封件材料的性质。这些过程的验证试验应适当地说明使得材料无菌和无热原的能力。书面程序应该规定这些过程再验证的频率,以及保持容器和密封件无菌、无热原的时间限度。
玻璃容器预灭菌准备通常涉及一系列的洗涤（如氢氧化钠溶液、纯化水）和冲洗（纯化水、注射用水）循环。这些循环在除去异物方面起了很重要的作用。冲洗用水必须高纯度，以免污染容器。对于非胃肠道用药,最后的冲洗水应该符合注射用水的标准。
除热原过程的适当性评价使用已知内毒素量的接种容器或密封件，然后测定其去热原后的内毒素含量。实施挑战性试验用重新标定的内毒素溶液，它可以直接放在表面上，并风干。阳性控制应该用于测定用测试方法回收的内毒素百分比。验证试验数据应该能够说明内毒素经过处理后减少了至少99.9
%。
玻璃容器一般用干热灭菌方法进行消毒灭菌和去热原。干热灭菌和去热原的验证应该包括适当的热分布和加热强度(热穿透)
试验，以及用最差状态过程，容器特性(如质量)
，负载配置等试验以体现实际的生产情况。
塑料容器的热原通常用多次注射用水冲洗除去。塑料容器也可以用适当的气体，辐射或其他适当的方法灭菌。气体灭菌可以用环氧乙烷，应该规定和密切注意环氧乙烷灭菌过程的参数和限度(如温度，压力，湿度，气体浓度，灭菌时间，除去气体，测定残留量)
。在表示环氧乙烷和气体气体灭菌过程的有效性时，生物指示剂具有特别重要的作用。
胶塞(如:塞子和针芯)
在最后蒸汽灭菌前要进行反复多次的洗涤冲洗循环清洁。至少最初洗涤过程冲洗的用水应该是纯水，为了把内毒素含量降低到最少，非胃肠道药品最后要用注射用水冲洗。一般通过多次用热的注射用水冲洗去热原。洗涤，干燥(如果需要时)，灭菌之间的时间应该尽量短，因为在塞子上残留的水分有利于微生物生长和产生热原。由于橡胶是热的不良导体，特别要注意验证过程中热量的利用，使之能够穿透胶塞负载。洗涤程序的验证应该能证明成功地把内毒素从橡胶制品中除去。胶塞硅化可能的污染源。制造胶塞时使用的硅应该符合适当的质量控制标准，对安全，质量，药品纯度不得产生负作用。委托生产单位的容器和密封件灭菌和/
或去热原也应该符合自己生产同样的GMP
要求。生产成品药生产商负责审查和批准受委托单位的验证计划和最后的验证报告。
3.6.2、容器/
密封系统的检查
能够让空气和微生物进入的容器密封系统是不适合用于无菌产品的。在检查最终密封产品时应该查出并剔除破损和有缺陷的产品。应该要有安全措施以保证产品的运送不会影响容器密封系统的完整性,并导致失去无菌性。设备的适当性问题或接收的容器或密封件的缺陷已经引起了密封系统的完整性丧失。例如:由于设备缺陷或由于半成品运送失当，没有检查出西林瓶的碎片。导致药品召回。如果破损没有检查出来导致容器密封系统完整性破坏,应该迅速修改程序防止和检测出这些缺陷。给药装置(如:针筒缺陷,给药体积)
的功能性缺陷也可能导致产品质量问题,应该通过适当的中间控制测试监控。在中间控制和最终检查中查出的任何缺陷或超过规格范围的结果都应该进行调查。
3.7
人的影响
3.7.1、人员：
无菌过程的良好设计可以将人员的影响降低到最小。因为无菌过程作业中操作人员的活动增加,成品无菌的危险性也增加。为了保证维持产品的无菌性,涉及无菌作业的操作人员应该在任何时候都要遵守基本的无菌技术原则。
任何人在允许进入无菌生产区和进行操作前都应该适当培训。这些培训应该包括无菌技术、洁净室行为准则、微生物学、卫生、着装、非无菌产品对病人安全性的危害、无菌生产区操作等专门书面程序。经过初步培训,人员还需要根据经常性培训计划进无菌过程的良好设计可以将人员的影响降低到最小。因为无菌过程作业中操作人员的活动增加,成品无菌的危险性也增加。
为了保证维持产品的无菌性,涉及无菌作业的操作人员应该在任何时候都要遵守基本的无菌技术原则。任何人在允许进入无菌生产区和进行操作前都应该适当培训。这些培训应该包括无菌技术、洁净室行为准则、微生物学、卫生、着装、非无菌产品对病人安全性的危害、无菌生产区操作等专门书面程序。
经过初步培训,人员还需要根据经常性培训计划进行定期新内容的培训。管理人员要定期评价在实际操作中操作人员是否遵守书面程序的规定。同样,质量控制部门也要定期监察生产作业中是否符合规定的书面程序,基本的无菌技术。
维护无菌物品和表面无菌性的技术包括:
◆只可用无菌仪器接触无菌物品
无菌仪器(如镊子),经常用于处理无菌物品。在使用间歇,仪器只应该放置在无菌容器中。需要时仪器可以在整个操作中替换。初步更衣后,无菌手套应该定期消毒,以尽可能减少污染危险。人员不得直接接触无菌产品,容器,密封件或关键表面。
◆缓慢,小心移动
快速移动会导致关键区域不可接受的湍流。这样的移动影响了无菌区域,使得挑战性试验不符合洁净室的设计和控制参数。缓慢,小心移动的原则适用整个洁净室。
◆保持整个身体不在单向空气流中
◆单向流设计用于保护无菌设备表面,容器、密封件和产品。在无菌生产区中,人员不得中断单向流通路。
◆进行合理操作以不影响产品的无菌性。
为了保证无菌产品周围环境的无菌性,人员应在产品的边上操作,不要在产品垂直单向流上操作。操作人员接近无菌生产线时,不得说话。
◆保证适当的着装控制。
在无菌作业前和整个无菌生产过程中,操作人员不得有任何对服装会造成污染的活动。只有合格的,着装适当的人员才能允许进入无菌生产区。无菌生产区着装应为人体和暴露的无菌产品之间提供屏障,防止人体产生的微粒和微生物污染。服装应该无菌,没有碎屑,覆盖整个皮肤、头发(面罩,头罩,胡须罩,防护眼镜,弹力手套,洁净室靴子和鞋套为着装中的常用物品)
应该有详细的书面程序说明用无菌方法穿着这些服装、部件的方法。着装各个部分之间应该重叠,以形成适当的屏障(如手套覆盖在衣袖上面)
。如果着装有撕裂或破损时,应该立即更换。应指定计划定期评价或审计人员和相关无菌生产的符合性。应有无菌着装验收计划以评价洁净室操作人员在执行着装程序后保证着装质量的能力。着装验收应包括在着装表面取样点上的微生物取样(如:手套手指部分,口罩,前臂,脸颊及其他部位)
。除了着装的最初评价,以后要定期再验收,并在一定时间后,监测不同的着装部位,以保证无菌着装技术持续的可接受性。对于自动化操作,半年一次或一年一次作再验收已经足够。因为人员没有涉及。为了保护暴露的无菌产品,人员应该保持着装的质量,严格执行无菌方法。应有适当的书面程序说明人员在什么情况下应重新培训、重新上岗或调离无菌岗位。
3.7.2、实验室人员
无菌生产区人员培训,无菌技术,人员资格的基本原则也可以用于其他的无菌取样和微生物实验室分析等岗位。如果实验室数据的有效性存在问题,就不能认为过程和系统是受到控制并有重复性的。
3.7.3、监督计划
人员能够严重影响无菌产品生产的环境质量。应该建立警惕和负责的人员监督计划。通过每位操作人员每天或每个批号手套表面取样分析来进行监督。取样过程应对其他战略性选择的着装位置规定适当的取样频率。质量控制部门应该给劳动强度特别大的操作人员建立完整的监督计划。(如:需要重复和复杂无菌作业的人员)
。
无菌对于无菌生产过程是最基础的。无菌生产区生产人员必须自始至终在整个操作过程中维持手套无污染。就在取样前进行手套消毒也是不适当的,因为它可能影响在无菌操作中的微生物回收。如果操作人员超过规定限度,或者有不良趋向,应该立即进行调查。并包括增加取样,增加观察,重新培训,重新验收着装,在某些情况下重新安排人员到无菌生产区以外工作。微生物趋向系统和非典型性趋向影响评估的详细讨论见Ⅺ实验室控制。
3.8
生产环境
无菌生产设施必须有隔开的操作区域,它可以适当控制以获得操作性质所要求的不同质量水平的空气。规定区域的设计应该基于满足设备、成分、产品在该区域操作中对微生物和颗粒的要求。无菌生产的关键区域和控制区域应该根据验收试验中获得的有关微生物和颗粒数据分级和支持。虽然,最初的洁净室验收应该包括在空态(as2built
)和静态条件下空气质量的评价,最后的洁净室和洁净区域的分级应该按照动态数据(即有人员存在,设备到位,操作在运行)
。无菌生产工厂监督系统也应该评价规定洁净区域在动态条件下日常运作时的符
合性。
具体可参考GMP无菌制剂要求。
四、总结
针剂制品的内毒素污染会导致CGMP
失控。一些病人(如新生儿),在同时接受其他针剂药物治疗时,或者非典型性大容量或大剂量非胃肠道用药时,与正常健康成人按照体重确定限度的用药更容易导致热原反应危险。这些临床上的忧虑更强化了实行适当CGMP
控制的必要性,以防止内毒素的生成。控制内毒素的最好方法关键就是控制原辅料，生产环境，工艺用水和无菌操作以及一个好的管理模式，环环相扣，任何一环马虎不得。工作中要严格遵循GMP要求